摘要在以嗜熱子囊茵生產(chǎn)過氧化氫酶的搖瓶發(fā)酵研究中，獲得了適合工業(yè)化生產(chǎn)的碳源，即以269／L的糊化玉米淀粉和1％(v／v)乙醇為混合碳源，過氧化氫酶的酶活達(dá)到了1996 u／n兒，比優(yōu)化前提高了25％。在此基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究了發(fā)酵罐上的主要影響因素溶解氧對(duì)發(fā)酵的影響，通過分段控制攪拌轉(zhuǎn)速，在52h將攪拌轉(zhuǎn)速從200r／rnin提高到350r／min，過氧化氫酶最高酶活達(dá)到4505 u／mL，與不使用控制溶氧水平策略相比，酶活力提高了2．4倍。此外，還考察了該酶去除過氧化氫的效率，并在實(shí)際紡織生產(chǎn)中進(jìn)行了應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，取得了良好的效果。
過氧化氫酶(ECl．11．1．6 catalaSe，簡(jiǎn)稱凹汀)是一種能夠高效催化分解過氧化氫的酶，幾乎存在于所有好氧生物的生物體內(nèi)，具有清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受超氧自由基損害等保護(hù)生物機(jī)體的作用。廣泛用于食品消毒、臨床分析、醫(yī)學(xué)診斷以及紡織、造紙、制漿等工業(yè)。近年來，隨著綠色環(huán)保意識(shí)與要求的不斷加強(qiáng)，在染整工藝中利用酶替代傳統(tǒng)的強(qiáng)堿高溫工藝對(duì)棉織物進(jìn)行前處理已成為大勢(shì)所趨。Q盯在棉織物前處理過程中的主要作用是去除織物漂白廢液中殘余的H202，以免給后續(xù)染色工序帶來問題【1]。應(yīng)用CAT實(shí)現(xiàn)漂染同浴，不僅能節(jié)省大量的水、電、汽的消耗，提高生產(chǎn)效率，還能減少廢水的排放，有利于環(huán)保。但是，現(xiàn)有商品CAT在高溫和強(qiáng)堿性環(huán)境下易失活，限制了CAT在染整工藝中的應(yīng)用。
CAT來源豐富，幾乎存在于所有好氧生物中。但來自動(dòng)物臟器以及一些微生物(如溶壁微球菌、球形紅假單孢菌、大腸桿菌、粗糙脈孢霉、微紫青霉、黑曲霉)的CAT，均不能忍受接近沸點(diǎn)的高溫和pH大于10的強(qiáng)堿性[3]。近20年來，關(guān)于嗜熱菌H’5]、嗜堿菌[6]或嗜熱嗜堿菌[7]產(chǎn)生凹汀的報(bào)道陸續(xù)出現(xiàn)，特別是嗜熱子囊菌所產(chǎn)的CAT是迄今為止已報(bào)道過的熱、堿穩(wěn)定性最好的CAT【8]，為開發(fā)耐熱耐堿的G盯提供了可能。
本研究室在前期研究中，篩選得到了一株金黃色嗜熱子囊菌WSH 03—01，該菌株發(fā)酵生產(chǎn)的CAT酶活較高，而且對(duì)熱和堿的穩(wěn)定性都較好，在紡織清潔生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用潛力。為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的條件，本文在上述實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，采用工業(yè)級(jí)碳源替代原先的試劑級(jí)碳源，在7L發(fā)酵罐上考察了其發(fā)酵生產(chǎn)已盯的可行性，在此基礎(chǔ)上，著重考察了溶解氧對(duì)發(fā)酵過程的影響，并驗(yàn)證了發(fā)酵生產(chǎn)所得的Q盯對(duì)過氧化氫的去除效率，最后，在染整清潔生產(chǎn)中進(jìn)行了應(yīng)用試驗(yàn)，取得了較好的效果。
1材料與方法
1．1材料
1．1．1 茵種
金黃色嗜熱子囊菌
1．1．2材料與儀器
全自動(dòng)發(fā)酵罐KFT-7 L(Korea Fennentor CO．，
Ltd，韓國)。
1．1．3培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基mA(每支茄式瓶)：6度麥汁30mL，瓊脂19，pH6．0。
種子培養(yǎng)基(g／L)：玉米淀粉15，蛋白胨4，酵母膏4，K2Ⅷ’04 1，Na2HP04 1，MgS04。7H20 5，pH6．8。
基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：玉米淀粉26，蛋白胨10，(NH)2S04 2，K2}Ⅱ氌5，KH2P04·3H20 3，Mg鼢·7H20 2，微量元素液2 mL，10rnL乙醇，pH7．O。
微量元素液(∥L)：FeQ H5 07·mO 6，Cacl2·2H20 4，Z蜘4‘7H20 2，MnCl2‘4H20 0．1，K1 0．1，(m)6M07Q4·4H20 0．1，C。C12·6H20 0．1，H38030．1，NaCl 5。
1．2實(shí)驗(yàn)方法
1．2．1培養(yǎng)方法
1)搖瓶培養(yǎng)：將成熟的孢子接種到P【)A斜面上，45℃培養(yǎng)13～16d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中孢子濃度為104個(gè)／mL)，45℃搖床培養(yǎng)52h。吸取種子培養(yǎng)液，按10％的接種量接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL搖瓶中裝100 mL培養(yǎng)基)，45℃搖床培養(yǎng)84 h。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均設(shè)三個(gè)平行樣。
2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將成熟的孢子接種到PDA斜面上，45℃下培養(yǎng)13～16d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中孢子濃度為104個(gè)／mL)，45℃培養(yǎng)52h，再以7％的接種量接入發(fā)酵罐，從48h開始流加乙醇直至發(fā)酵結(jié)束，通氣量1：1，200r／nlin，52h后調(diào)整為350r／nlin。
1．2．2發(fā)酵液揮發(fā)量的校正
發(fā)酵過程在高溫下進(jìn)行且周期較長，培養(yǎng)基中水分的揮發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)有較大影響，因此在發(fā)酵結(jié)束后采用稱重補(bǔ)水法進(jìn)行校正。將接種后的搖瓶用電子天平(0．019)記錄初始質(zhì)量，發(fā)酵結(jié)束后，分別將去離子水補(bǔ)人相應(yīng)搖瓶至初始值。恢復(fù)質(zhì)量后的發(fā)酵液再用于發(fā)酵液各項(xiàng)參數(shù)的分析測(cè)定。
由于發(fā)酵罐發(fā)酵體積較大，故發(fā)酵結(jié)束后未對(duì)發(fā)酵液揮發(fā)量進(jìn)行校正。
1．2．3生物量測(cè)定
取50 mL發(fā)酵液進(jìn)行真空抽濾，收集濕菌體，用蒸餾水洗滌2次后，置105℃下恒溫干燥至恒重，用稱重法測(cè)定生物量。
1．2．4過氧化氫酶活性測(cè)定
采用分光光度法在25℃下測(cè)定[10|。反應(yīng)總體積為3 mL，含0．1n1L酶液和2．9mL含有10 mmol／L H202的50 n蚰ol／L的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉緩沖液(pH 7．0)。過氧化氫的分解速率用752型紫外一可見光分光光度計(jì)在240 m下測(cè)定。酶活定義為：在上述條件下，每分鐘分解1肛m01 H202所需的酶量為一個(gè)酶活單位。
1．2．5 還原糖的測(cè)定：3，5一二硝基水楊酸比色法[11|。
1．2．6總糖的測(cè)定：蒽酮比色法[12】。
1．2．7染整清潔生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用工業(yè)化試驗(yàn)
試驗(yàn)地點(diǎn)：無錫天時(shí)針織有限責(zé)任公司
試驗(yàn)樣本：150kg純棉布
傳統(tǒng)工藝：漂白(過氧化氫)一冷水洗(溢流，10rnin)一熱水洗(98℃，10 H1in)一冷水洗(5～10 rnjn)1～2次一染色。
酶法工藝：漂白(過氧化氫)一冷水洗(溢流，10rnjn)一酶處理(10L酶液，約1．5萬u／mL，20 rnin，60℃)一熱水洗(98℃，10刪n)一染色。
色差測(cè)試：采用上海精密儀器廠生產(chǎn)的WSeC型測(cè)色色差計(jì)測(cè)定
2結(jié)果與討論
2．1發(fā)酵工藝碳源的確定
前期研究表明，T．n亂m咒￡inc“s WSH 03—01對(duì)單糖和雙糖的利用較差，當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，濃度超過4 g／L后產(chǎn)Q盯的濃度迅速降低，而當(dāng)濃度達(dá)到20 g／L時(shí)，發(fā)酵終了時(shí)Q盯酶活極低(<10 u／mL)，且發(fā)酵液的pH均降至3以下[9J。與此相反，該微生物菌株以209／L英國膠(糊精的一種)作為碳源時(shí)，卻表現(xiàn)出良好的生長與產(chǎn)酶特性【9]。但是英國膠沒有工業(yè)化產(chǎn)品，不適合作為大規(guī)模生產(chǎn)的原料。因此，需要選擇一種適合于工業(yè)化的相近原料進(jìn)行替代。
研究中選擇的碳源是常用的工業(yè)原料，在搖瓶條件下比較了不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖1，兩種型號(hào)的糊精TF．AC0500和糊精SPO．M0350(由天津頂峰變性淀粉生產(chǎn)有限公司提供)的DE值(葡萄糖當(dāng)量，DE值越高表示水解程度越高)與英國膠相似，且菌體生長無較大差異，但是其產(chǎn)酶效果與英國膠(209／L)相比降低了40％左右。麥芽糊精為碳源時(shí)菌體干重(DICW)比對(duì)照有提高，但對(duì)產(chǎn)酶作用不明顯。使用液化后玉米淀粉作為碳源時(shí)，酶活比對(duì)照下降了80％。相比之下，以糊化后的玉米淀粉為碳源時(shí)有利于菌體的生長，比英國膠和麥芽糊精的酶活分別提高了6％和50％。
從以上結(jié)果，可以認(rèn)為溶解氧在T發(fā)酵產(chǎn)CAT中具有較為重要的影響。根據(jù)該微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的周期特點(diǎn)，我們采用分段控制攪拌轉(zhuǎn)速的策略，以獲得不同的溶氧水平，即發(fā)酵前期攪拌轉(zhuǎn)速控制在200r／min，52h后提高到350r／min，在此條件下考察其發(fā)酵過程，結(jié)果如圖3所示。可以看出，發(fā)酵前52h菌體生長較快，轉(zhuǎn)速提高后菌體的生長速度有所降低，在74h達(dá)到最大值10．969／L；而T．口亂m，z￡缸c“s WSH 03—01合成Q盯的速度在經(jīng)過53—63h的平穩(wěn)期之后明顯加快，112h時(shí)CAT酶活力達(dá)到最大4505 u／mL，與不使用分段控制攪拌轉(zhuǎn)速發(fā)酵罐最高酶活1851 u／mL相比，酶生產(chǎn)率提高了2．4倍，DCW也從9．96∥L提高到了11．29／L，這一結(jié)果表明，分階段控制溶解氧在提高酶活與促進(jìn)菌體生長方面具有明顯效果。
此外，對(duì)發(fā)酵過程中的pH變化考察可以發(fā)現(xiàn)，在45h前pH一直呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這是由于碳源分解形成的酸性中間產(chǎn)物造成的，這也表明菌體處于旺盛的生長期。45h后pH開始回升，同時(shí)a盯合成速率也增加，pH的回升正好與產(chǎn)酶進(jìn)入高峰期相對(duì)應(yīng)，掌握這一特征現(xiàn)象在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中是十分有利的。
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