摘要目的：建立百合中總生物堿的含量測(cè)定方法。方法：采用酸性染料比色法測(cè)定總生物堿含量。以秋水仙堿為對(duì)照品，溴甲酚綠為酸性染料，在pH3.6緩沖溶液條件下，用氯仿萃取，于414nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并測(cè)定了4個(gè)產(chǎn)區(qū)的百合中總生物堿的含量。結(jié)果：秋水仙堿在120~200μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=0.0019C+0.0014（r=0.9997）；秋水仙堿的平均加樣回收率為（101.8±1.59）%，RSD=1.57%（n=6）。結(jié)論：所建立的總生物堿測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，為百合質(zhì)量的控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
關(guān)鍵詞：百合 總生物堿 酸性染料比色法
中藥百合為百合科植物卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）、百合（Lilium brownii F.E.Brownii var.viridulum Baker）或細(xì)葉百合（Lilium pumilum DC.）的干燥肉質(zhì)鱗葉，味甘、寒，歸心、肺經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清心安神之功效[1]。現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究證實(shí)，百合除了具有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、助眠、抗疲勞、耐缺氧等功效外，還具有較好的抗腫瘤活性，其抗腫瘤的主要活性成分為生物堿類成分[2]，包括秋水仙堿，以及與秋水仙堿結(jié)構(gòu)相似的卓酚酮類生物堿。但目前尚未有其含量測(cè)定的研究，因此有必要對(duì)百合中所含的總生物堿進(jìn)行含量測(cè)定。本研究采用酸性染料比色法，以秋水仙堿為對(duì)照品，建立了百合中主要成分總生物堿的含量測(cè)定方法，并對(duì)江蘇宜興、甘肅蘭州、浙江湖州、湖南龍山四大產(chǎn)區(qū)百合中的總生物堿進(jìn)行了含量測(cè)定，為更好地控制百合質(zhì)量，使其充分發(fā)揮抗腫瘤藥效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1·儀器、試劑與材料
UV-2802型紫外可見分光光度計(jì)（龍尼柯上海儀器有限公司）；METTLER TOLEDO分析天平、十萬(wàn)分之一分析天平、METTLER TOLEDO 320 pH計(jì)（METTLER TOLEDO分析儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠）。秋水仙堿對(duì)照品（純度>99%，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）；百合藥材，均購(gòu)于安徽亳州藥材有限公司（產(chǎn)地：湖南龍山20110523，甘肅蘭州20110523，經(jīng)鑒定為百合科植物百合；江蘇宜興20100809，浙江湖州20110523，經(jīng)鑒定為為百合科植物卷丹），其余試劑均為分析純。 醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH3.6）：取醋酸鈉5.1g，加冰醋酸20mL，再加水稀釋至250mL，即得[1]。 0.05%溴甲酚綠酸性染料的配制：精密稱取溴甲酚綠0.05g，加pH3.6醋酸-醋酸鈉溶液溶解至100mL，搖勻，即得。
2·方法與結(jié)果
2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的秋水仙堿對(duì)照品10mg，置于50mL容量瓶中，用pH 3.6醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，并稀釋定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.2mg/mL的秋水仙堿對(duì)照液。
2.2供試品溶液的制備精密稱取百合粉末1.0g置于干燥的100mL圓底燒瓶中，加入pH 3.6醋酸-醋酸鈉緩沖液50mL，加熱回流提取1h，離心，抽濾，濾液減壓濃縮后，定容至25mL，即得供試品溶液。
2.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇精密吸取秋水仙堿對(duì)照液與百合供試品溶液各3mL，置于分液漏斗中，分別精密加入溴甲酚綠5mL，再加入氯仿10mL，振搖3min，靜置30min，分取氯仿層，并加入0.5g無(wú)水硫酸鈉，放置0.5h。另取醋酸-醋酸鈉緩沖液3mL，同法操作，所得氯仿液為隨行空白液。分別在400～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，秋水仙堿對(duì)照液和百合供試品溶液在414nm處均有最大吸收，故選擇414nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取秋水仙堿對(duì)照液0.0、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、3.0mL，置于分液漏斗中，再分別補(bǔ)加3.0、2.1、1.8、1.5、1.2、0.9、0.6、0.0mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 3.6），精密加入溴甲酚綠5mL，再分別加入氯仿10mL，振搖3min，靜置30min，分取氯仿層，并加入0.5g無(wú)水硫酸鈉，放置0.5h。以醋酸-醋酸鈉緩沖液3mL為隨行空白對(duì)照，于414nm處依法測(cè)定吸光度。以秋水仙堿對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=0.0019C+0.0014（r=0.9997），結(jié)果表明，秋水仙堿的質(zhì)量濃度在120~200μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
2.5精密度試驗(yàn)精密量取0.2mg/mL秋水仙堿對(duì)照液3.0mL，置于分液漏斗中，參照“2.4”項(xiàng)下方法操作，于414nm處依法測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果RSD=0.79%，說(shuō)明儀器所測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。
2.6重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取湖南龍山百合（批號(hào)：20110523）粉末6份，各1.0g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液3.0mL，置于分液漏斗中，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，于414nm處依法測(cè)定吸光度，計(jì)算其平均含量為0.627%，RSD為0.84%。結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性良好。
2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取“2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液3.0mL，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，顯色后分別在0、5、10、20、30、40、50min于414nm處依法測(cè)定其吸光度。RSD為0.56%，表明其在50min內(nèi)穩(wěn)定。
2.8加樣回收率試驗(yàn)精密吸取6份已知濃度的供試品溶液各1.5mL，分別精密加入1.5mL秋水仙堿對(duì)照品溶液（濃度為0.250mg/mL），混勻，比色測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算回收率。秋水仙堿的回收率為（101.8±1.59）%（n=6），結(jié)果見表1。
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