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1.2.4紅外光譜的測定

將濃縮至渾濁的色素溶液高速離心，去上清液后置于烘箱中60℃烘干，取少量色素粉末于紅外燈下烘干后加入適量溴化鉀混勻壓片，測其紅外吸收光譜。

1.2.5高效液相色譜分離

將稀釋后的棕色棉色素和白色棉棉籽殼色素水溶液按如下色譜條件進行分離:柱溫30℃，流速1mL/min，進樣量20μL，檢測波長280nm。流動相為乙腈(A相)和0.5%的甲酸水溶液(B相)，采用梯度洗脫，流動相配比為:0～10min，80%～50%A;10～20min，50%～30%A;25min，30%A。

2結果與分析

2.1色素化學成分的初步鑒定

顯色反應是鑒定天然產物的主要方法之一。觀察樣品與診斷試劑反應后的顏色及是否產生沉淀即可推測出樣品的化學成分。天然棕色棉色素和白色棉棉籽殼色素的化學試劑顯色反應結果如表1所示。天然棕色棉色素和白色棉棉籽殼色素與鹽酸鎂粉、醋酸鎂、硼氫化鈉、硼酸的反應均為陰性，結合圖1中的紫外光譜特點，可以排除2種色素為黃酮類、二氫黃酮類、查爾酮類的可能性。與氯化鋁無反應，說明2種色素不具有典型的蒽醌類結構。與三氯化鐵反應均呈墨綠色，與醋酸鉛反應均有棕色沉淀生成，說明2種色素都是含有鄰二酚羥基的多酚類化合物。向2種色素滴加pH=4的明膠水溶液，色素溶液立即變渾濁，放置12h后均有肉色沉淀生成;2種色素與濃硫酸反應均有紅棕色沉淀生成;向點在硅膠板上的2種色素噴灑1%FeCl3溶液，色素斑點呈暗綠色，再經茴香醛硫酸溶液顯色均為橙色，這些反應都呈現縮合單寧的特征。向色素的醋酸鉛沉淀物滴加過量的醋酸，棕色棉色素大部分溶解，白色棉棉籽殼色素沉淀物全部溶解，這也符合縮合單寧類的反應特點。向點在濾紙上的2種色素噴灑鹽酸香草醛溶液，白色棉棉籽殼色素斑點呈現粉紅色，而棕色棉色素斑點略帶紅色，表明前者主要成分含有間苯三酚結構，后者含該結構的成分含量很低。2種色素與菲林試劑反應均有少量磚紅色沉淀生成，表明2種色素中某些含量較低的成分含有葡萄糖糖苷。

2.2色素的紫外可見光譜分析

縮合單寧是羥基黃烷類化合物以碳—碳鍵相聯縮合而成，具有C6—C3—C6的結構，各單體內及單體間的苯環之間并未形成共軛結構。縮合單寧前體黃烷醇類本身無色，在植物體內相關酶的作用下氧化縮合而顯淺黃至暗紅棕色，縮合程度越高，其顏色也越深。天然棕色棉色素與白色棉棉籽殼色素的紫外可見光譜如圖1所示。圖中顯示2種色素都有2個吸收峰，均為芳環的特征吸收帶，天然棕色棉色素和白色棉棉籽殼色素的E2帶分別為200nm和204nm，B帶分別為275nm和280nm。黃烷醇類單寧除了在200nm左右有1個E帶吸收峰外，在280nm左右還有1個中等強度的B帶吸收峰。相關文獻記載，黑荊樹皮單寧(主要成分為低聚原花色素)的分光光度定量測定波長為203nm和280nm，其紫外光譜特點與棕色棉色素和白色棉棉籽殼色素十分相似。結合2種色素的顯色反應和紫外光譜特點，確定棕色棉色素和白色棉棉籽殼色為同一類物質，即縮合單寧類化合物。

多酚類化合物由于酚羥基的存在，加入相應的診斷試劑后，UV-VIS光譜會發生變化，這種性質可用于判斷化合物的結構及羥基所在的位置。診斷試劑一般為弱堿或金屬鹽，加入弱堿可使酚羥基離解形成負氧離子，增大共軛系統的電子云密度，使紫外光譜紅移，酸的存在會緩解酚羥基的離解，從而使紫外光譜紅移幅度減小。由于酚羥基被氧化成共軛羰基，縮合單寧氧化成的醌類物質的紫外光譜在弱堿的作用下不會產生以上變化。加入診斷試劑后棕色棉色素的紫外光譜變化情況如圖2所示。由圖可知，棕色棉色素的E2帶和B帶吸收峰分別在200nm和275nm處，加入醋酸鈉后吸收帶分別紅移至203nm和279nm，而向色素水溶液中滴加醋酸鈉/硼酸后測得的2個吸收帶分別位于203nm和276nm處。對比向色素溶液滴加醋酸鈉后掃描的結果，紅移幅度減小。診斷結果表明色素分子苯環上的酚羥基是存在的，棕色棉色素主要成分不是縮合單寧氧化成的醌類物質。相關著作記載，植物體內的單寧類化合物是不穩定的，在氧氣和多酚氧化酶的作用下會被氧化成苯醌類化合物，苯醌類化合物也很不穩定，容易被其他物質中的氫還原，特別是具有鄰二酚羥基結構的單寧類，被氧化成鄰苯醌后，遇到自身的氧化前體(或含氫的溶劑)可在短時間內被還原。若鄰二酚羥基處于B環上，氧化而成的鄰苯醌與自身的氧化前體反應時，除了被還原成前體外，還有對苯醌生成。對苯醌較穩定，不易被還原成酚類，所以，棕色棉色素的主要成分是縮合單寧類，可能含有少量的縮合單寧氧化而成的苯醌類化合物。

2.3色素的紅外吸收光譜分析

純化后天然棕色棉色素與白色棉棉籽殼色素的紅外光譜如圖3所示。由圖可知:天然棕色棉色素與白色棉棉籽殼色素在3395cm－1處均有強而寬的羥基伸縮振動吸收峰，2920、2850cm－1為甲基或亞甲基的對稱與非對稱伸縮振動帶，這說明2種色素的某些成分含有糖苷。1620、1451cm－1處為棕色棉色素芳香骨架的振動吸收帶，1123cm－1處為苯環上C—O的伸縮振動吸收峰，1384cm－1處為酚羥基的面內彎曲振動峰。與棕色棉色素不同，白色棉棉籽殼色素芳香骨架的振動吸收帶位于1608、1510、1450cm－1處，而1270、1073cm－1處為芳香醚(Ar—O—C)的振動吸收帶。2種色素分別在1708、1697cm－1處有吸收強度較弱的非共軛羰基吸收峰。這是由于含羰基的組分在色素混合物中所占比例較少。IR波譜特點也符合2種色素是縮合單寧類的論斷。