2·1·2 流動相的確定 考察了分別采用甲醇-磷酸鹽(圖1A)和甲醇-Tris緩沖液為流動相(圖1B)時的分離效果。結果表明, 2種緩沖溶液的分離效果相當,混合芳香胺得到很好的分離。對于2, 6-二甲基苯胺和2, 4-二甲基苯胺(圖1中13、14號峰),采用磷酸鹽緩沖液的分離效果明顯優于Tris緩沖溶液。因此本實驗選擇甲醇-磷酸鹽緩沖溶液為流動相。
2·1·3 定容溶劑的選擇 許多芳香胺存在同分異構體,如:鄰甲苯胺與對甲苯胺、對氯苯胺與間氯苯胺、2, 4-二甲基苯胺與2, 6二甲基苯胺、1-萘胺與2-萘胺等[18]。采用單一的GC-MS或HPLCDAD方法時,對于某些同分異構體的芳香胺不能準確定性,因此經常需要同時采用2種色譜檢測手段。在原SN/T 1045·1-2002標準中,最后一步操作須將提取的芳香胺用二氯甲烷從水相萃取后,將二氯甲烷轉移出,再氮氣吹干,甲醇溶液定容,步驟繁瑣,極易造成損失。本實驗最后一步加入甲基叔丁醚作為定容介質,以滿足處理后的樣品在HPLC和GC -MS上同時進樣的要求。實際在HPLC上對分別以甲基叔丁醚和甲醇為溶劑配制的芳香胺標準品進行分離,比較發現甲基叔丁醚溶劑標準品中2, 4-二氨基甲苯和2, 4-二氨基苯甲醚(圖2, 1、2號峰)峰形尖銳,分離效果明顯優于甲醇溶劑標準品,但是2, 6-二甲基苯胺和2, 4-二甲基苯胺(圖2, 13、14號峰)無法分離。其余峰的分離情況二者無顯著差異。綜合考慮, HPLC進樣前,在進樣瓶中將甲基叔丁醚溶劑吹干替換為甲醇溶劑。為保證氮氣吹干過程中不損失或盡量減少待測物質的損失,吹干前先加入微量1 mol/L鹽酸與待測芳香胺成鹽,吹干后再用等量1 mol/L氫氧化鈉與生成的鹽反應將芳香胺釋放出。
2·2 前處理條件的優化
2·2·1 提取溶劑的優化 SN/T 1045·1-2002標準中以乙醚為提取溶劑。乙醚在使用前需要除去過氧化物并進行重蒸餾,且乙醚的沸點低,在蒸餾過程中易爆。本實驗將乙醚改為甲基叔丁醚,大大提高了實驗的安全性,簡化了實驗步驟,同時加標回收實驗結果表明,待測芳香胺的提取效率不受影響。
2·2·2 凈化試劑的優化 將SN/T 1045·1-2002標準中凈化試劑十一鎢硅酸鉀改為十一鎢硅酸鈉。由于鈉鹽比鉀鹽的可溶性強,不易析出晶體,因此更便于保存,可以有效延長試劑的使用周期。比較了分別以十一鎢硅酸鉀和十一鎢硅酸鈉為凈化試劑,采用本方法在30 mg/L水平進行加標回收實驗。對實驗結果進行t檢驗(95%置信區間,自由度為2),得到23種芳香胺的t值均小于t0·05,2(t0·05, 2=4·30),表明鈉鹽和鉀鹽的凈化效果無顯著性差異。
比較了以新配制的Na鹽和1個月前配制的Na鹽為凈化試劑,本方法在30 mg/L水平進行3次加標回收實驗,經t檢驗(95%置信區間,自由度為2), 23種芳香胺的t值均小于t0·05,2(t0·05, 2=4·30),表明二者無顯著性差異。此外,還對1個月內3個不同時間配制的鈉鹽樣品進行了紫外光譜分析,結果表明三者的特征吸收一致,十一鎢硅酸鈉穩定無變化,有效期為30d。
2·3 回收率與精密度實驗
以pH 6·0的檸檬酸鹽緩沖溶液模擬人體的汗液環境,分別加入7·5、15、30mg/L 3個水平的芳香胺標準品進行回收實驗,每一水平分別做6個平行樣品,相對標準偏差和平均回收率數據見表1。
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