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隨著染料化學工業的迅猛發展,紡織、皮革、食品、日用化工等行業越來越多地應用合成染料于生產中.我國的染料年產量達到15萬t[1],其中10%~15%會隨著廢水排入環境中[2].由于染料含有復雜的芳香環結構、品種繁多、化學穩定性高、生物可降解性低,且多數染料及其代謝中間產物具有致突變性、致癌性和其他毒性.染料廢水對環境的污染已是廣大環保科學工作者重點關注的問題之一.由于微生物具有繁殖速度快、適應性強等特點,利用高效脫色微生物進行環境污染整治不僅成本低,且可減少二次污染的產生,因此,采用生物法對染料污染進行治理越來越受到人們的關注[3-5].目前已證實多種偶氮、蒽醌等結構類型的染料均可被微生物降解,分離到的微生物主要包括細菌、真菌等.但對染料的微生物降解研究主要集中于偶氮染料[6-9],對于三苯甲烷類染料的研究報道較少.本文用三苯甲烷類染料堿性孔雀綠為試驗材料,以細菌對其脫色率為檢測指標,從福建石獅錦尚和伍堡污水處理廠不同的曝氣池活性污泥中分離篩選對堿性孔雀綠染料脫色能力強的高效菌株,并對分離到的株菌進行鑒定,為印染廢水的處理提供參考.
1·材料與方法
1.1材料
1.1.1分離樣品
采自福建石獅錦尚和伍堡污水處理廠不同曝氣池的活性污泥.1.1.2染料
采用三苯甲烷類的染料堿性孔
1.1.3培養基
富集培養基:KH2PO41.8 g,Na2HPO4·12H2O 3.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeCl3·6H2O 0.01g,蛋白胨2.0 g,牛肉膏3.0 g,葡萄糖5.0 g,染料0.05 g,蒸餾水1 000 mL,pH7.0,121℃滅菌20 min.
生長培養基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1 000 mL,pH7.0~7.2,121℃滅菌20 min.
染料培養基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,染料50 mg/L,蒸餾水1 000 mL,pH7.0~7.2,121℃滅菌20 min.
脫色培養基:麥芽糖3%,染料50 mg/L,硝酸銨1%.
染料固體培養基:染料培養基,瓊脂20 g,pH 7.0~7.2,121℃滅菌20 min.
1.1.4儀器
SPX-250B-Z生化培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠),光學顯微鏡PM-10AD(Olympus),恒溫搖床HQ45(武漢科學儀器廠),滅菌消毒器CRDX-280型(上海電安醫療器械廠),分光光度計723(上海精密科學儀器有限公司),電子天平(上海精科天平廠),臺式離心機(上海安亭科學儀器廠),CS-15R冷凍高速離心機(Beckman),pHS-3C精密酸度計(上海雷磁儀器廠),SW-GF-1F潔凈工作臺(上海博訊實業有限公司醫療設備廠).
1.2方法
1.2.1富集及分離
從污水中取出5 mL的樣品,接入含50 mL富集培養基三角瓶中,30℃靜置培養24 h,取出染料顏色有變化的三角瓶,取脫色菌液,經適當稀釋涂布于含染料的固體分離培養基平板上,30℃恒溫培養3~5 d,根據菌落形成的脫色圈,挑選出具有脫色能力的菌株,接種于含50 mg/L染料培養基培養3
1.2.2純化
將分離挑取的單菌落在平板上劃線、純化,并鏡檢純度.經過多次挑單培養后得到純培養.
1.2.3脫色能力的測定
用牛肉膏蛋白胨培養基搖床振蕩培養菌體到一定的濃度進行純種擴大培養,取1 mL培養好的菌液,加到含20 mL脫色培養基的100 mL錐形瓶中,30℃靜置培養,24 h后取樣,3 500 r/min離心30min,在617 nm處測定上清液的吸光度值,并以不加菌的脫色培養基為對照,計算脫色率,以脫色率的大小來表示染料的脫色能力.
式中,A為不加菌液的吸光度值,B為接菌培養一定時間后上清液的吸光度值,選擇脫色效果好的菌株進行鑒定.
1.2.4菌株鑒定
參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[10]和《一般細菌常用鑒定方法》[11]對分離純化后的菌株進行形態特征、生理生化特征、菌體染色等鑒定.
B2菌株和B6菌株進一步采用美國BD phoenixTM全自動細菌鑒定/藥敏系統自動鑒定,由福建省疾病控制中心完成.
2·結果與討論
2.1篩選結果
經過篩選,得到了7株對三苯甲烷染料堿性孔雀綠有比較好的脫色效果的細菌(見表1),7株菌株分別編號為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7.
由表1可知,不同的菌株對染料脫色效果不同,B2菌株脫色效果最好,脫色率高達99.19%.
2.2初步鑒定
2.2.1菌體染色結果
不同菌株染色結果如表2所示.
2.2.2培養特征
菌株在營養瓊脂平板上劃線,于28℃培養18~24 h,觀察菌落的形態、大小和生長情況.B1菌株:菌落為淡黃色,菌落偏小,直徑為3~4 mm,邊緣圓整,規則,放射狀,臍狀.
B2菌株:菌落為白色,菌落較大,直徑為7~8 mm,有同心圓,邊緣圓整,表面光滑濕潤,有光澤,扁平,有莢膜特征.
B3菌株:菌落為白色,菌落中等,直徑為5~6 mm,邊緣圓整,表面光滑濕潤,有光澤,草帽狀.<
B5菌株:菌落為淡黃色,菌落較小,直徑為2~3 mm,邊緣圓整,表面光滑濕潤,有光澤,草帽狀.
B6菌株:菌落為白色,菌落中等,直徑為4~5 mm,邊緣圓整,表面光滑濕潤,有光澤,低凸起.B7菌株:菌落為淡黃色,菌落中等,直徑為5~6 mm,邊緣圓整,規則,放射狀,扁平.
