梔子(Gardenia jasmonoides L.)屬于茜草科植物，作為傳統(tǒng)中草藥在我國應(yīng)用于疾病治療已經(jīng)有1 600多年的歷史. 梔子果實中梔子苷的主要化學(xué)成分為京尼平苷(Geniposide)，京尼平苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解得到京尼平(Genipin)，二者在生物醫(yī)學(xué)材料和材料工程[1, 2]、食品和色素添加劑[3]、中藥保肝利膽[4, 5]、抗癌和抗炎癥[6, 7]、生物檢測[8, 9]以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)增產(chǎn)[10, 11]等方面有著廣泛的應(yīng)用.
我國是養(yǎng)蠶大國，2007年全國桑園面積為9.607×107 m2，蠶繭產(chǎn)量7.927×108 kg[12]. 我國現(xiàn)有蠶絲出口可以占到世界蠶絲出口總量的70%，但在獨立開發(fā)應(yīng)用上只占0.5%，如何增強對蠶絲的深加工、提高蠶絲的綜合利用價值，成為困擾我國絲綢工業(yè)和廣大蠶農(nóng)的一個重大問題. 此外，由于知識的普及和安全意識的增強，人們越來越意識到化學(xué)合成染料對人體造成的傷害和和對環(huán)境造成的污染，這在一定程度上也限制了絲綢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展. 京尼平具有低的細(xì)胞毒性[13]，對膠原、明膠等具有交聯(lián)作用，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料和藥品包裝等方面[2]，目前關(guān)于京尼平與蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的機理還沒有統(tǒng)一的認(rèn)識. 現(xiàn)有研究表明，在一定條件下，京尼平與氨基酸能夠進(jìn)行呈色反應(yīng)生成梔子藍(lán)色素[14]. 因此，本文以蠶絲和制備的絲素蛋白為材料，對京尼平的染色作用和影響因素進(jìn)行了探討，對交聯(lián)反應(yīng)顏色產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，并通過紫外可見光和熒光光譜測定的方法，初步考察了京尼平與絲素蛋白交聯(lián)顏色反應(yīng)的機理.
1 材料與方法
1.1 材料
蠶絲購于成都市場，京尼平購自上海滬云醫(yī)藥科技公司(相對分子質(zhì)量226，純度≥98%)，配制緩沖液試劑及其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純.
稱取蠶絲(除去蠶繭等雜質(zhì)) 1 g置于20 mL 0.05 mol/ L NaHCO3溶液中，在沸水浴中煮3~4 min，重復(fù)2~3次以完全去除絲膠，清水洗凈后烘干. 再于80 ℃水浴條件下于500 g/L CaCl2中溶解，自然冷卻后透析過夜，AgNO3檢測合格后，用Bradford法測定絲素蛋白溶液濃度.
1.2 實驗方法
剪成小段的蠶絲，放入4支試管中，分別加入2 mL 濃度分別為1、2 mg/ mL的京尼平水溶液(pH 5.5) 和1、2 mg/ mL京尼平的PBS (pH 8.0)溶液，密閉后于80 ℃水浴條件下浸泡反應(yīng)2 h，待清水沖洗后，晾干，拍照.
3 mL絲素蛋白水溶液(1 mg/ mL)中，加入450 μL的0.1%京尼平溶液，于35 ℃水浴放置，反應(yīng)不同時間后，以相同濃度的絲素蛋白溶液為參比，對反應(yīng)溶液進(jìn)行吸收光譜掃描200~800 nm，找出最大特征光吸收值.
1.3 溫度、酸堿度等因素對反應(yīng)的影響
分別取1 mg/ mL絲素蛋白水溶液3 mL置于兩支試管(試管標(biāo)號：1、3)中和PBS (pH 8.0)溶液3 mL置于兩支試管(試管標(biāo)號：2、4)中，加入450 μL的1 mg/ mL京尼平溶液后，將1、2試管置于80 ℃水浴中2 h，3、4于35 ℃水浴中反應(yīng)48 h，測定吸收光譜，并進(jìn)行拍照. 考查酸堿度的影響時，采用不同的緩沖溶液，pH 3 (硼砂與硼酸)、pH 5 (乙酸鹽)、pH 7和8 (磷酸鹽)、pH 10和11 (碳酸氫鈉與氫氧化鈉)、pH 12 (磷酸鹽與氫氧化鈉)，分別配制的3 mL絲素蛋白溶液，加入450 μL的1 mg/ mL京尼平溶液，80 ℃條件下反應(yīng)2 h后測定A590 nm值，并以1 mg/ mL絲素蛋白溶液為參比，進(jìn)行紫外與可見光吸收光譜(200~800 nm)掃描.
1.4 熒光光譜測定
向兩試管中加入1 mg/ mL的絲素蛋白PBS (pH 8.0)溶液3 mL， 然后分別加入PBS (pH 8.0)和1mg/ mL的京尼平溶液450 μL，在35 ℃條件下反應(yīng)，取2 min、0.5、3、6、24、48 h的反應(yīng)產(chǎn)物，用PBS (pH 8.0)稀釋4倍后在35 ℃條件下進(jìn)行熒光光譜測定，測定采用Hitachi Fluorescence Spectrctrctrophotometer F-4500記錄300~700 nm的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)光波長為280 nm [15]，數(shù)據(jù)導(dǎo)出后利用Origin 7.5作圖分析.
1.5 溶液反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性分析
京尼平與絲素蛋白溶液(京尼平與絲素蛋白質(zhì)量比為15%)在80 ℃水浴條件下反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定后，于室溫條件下密閉放置1 mo后測定A590 nm值；自然光強條件下放置，每隔1 h測定一次至6 h；或進(jìn)行光照處理，處理時光照條件(光源：1 000 W鹵化物燈，光強：5 000 lx)，持續(xù)照射6 h，每隔1 h測定一次A590 nm值，求出A/A0 (A表示測定時光吸收值，A0為最初光吸收值)值，利用Origin 7.5作圖分析.
2 結(jié)果與分析
2.1 蠶絲在京尼平溶液中浸泡染色
蠶絲浸泡于無色的0.1%京尼平溶液中，于80 ℃條件下2 h蠶絲會染成藍(lán)色，晾干后呈藍(lán)黑色(圖1) . 實驗過程中發(fā)現(xiàn)，蠶絲染上顏色的快慢與京尼平溶液的濃度及pH相關(guān)，在0.2%京尼平溶液中快于0.1%京尼平溶液中，在PBS (pH 8.0)溶液中快于水溶液(pH 5.5)中. 晾干染色蠶絲的深淺也顯示與京尼平溶液的濃度及pH相關(guān)，使用水溶液的顯紫黑色，使用PBS (pH 8.0) 溶液的顯青黑色.
2.2 京尼平與絲素蛋白溶液的顏色反應(yīng)
以蠶絲為原料，制備絲素蛋白溶液，進(jìn)一步在液體狀態(tài)下，分析京尼平對無色的絲素蛋白的染色過程與影響因素. 采用兩種溫度(35 ℃和80 ℃)與兩種pH (pH 5.5和pH 8.0)條件，發(fā)現(xiàn)其他條件相同時，溫度對京尼平染色絲素蛋白有顯著影響，35 ℃時反應(yīng)48 h的溶液顏色較淺，而80 ℃時反應(yīng)2 h的溶液顏色較深，這存在典型的溫度效應(yīng)，表明發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)(圖2). 反應(yīng)體系的pH影響生成產(chǎn)物的顏色，pH 5.5時為藍(lán)色而pH 8.0時為藍(lán)紫色. 此結(jié)果表明不同溫度和pH條件下，反應(yīng)進(jìn)行程度和反應(yīng)產(chǎn)物的顏色不同.
2.3 京尼平與絲素蛋白溶液反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜與熒光光譜分析
利用紫外可見光光譜掃描，檢測京尼平與絲素蛋白溶液反應(yīng)過程中體系吸收光譜變化. 未反應(yīng)前，京尼平水溶液只在242 nm處具有最大特征光吸收值，而絲素蛋白水溶液在230 nm處具有肽鍵的吸收峰，280 nm處具有典型的蛋白質(zhì)吸收峰，可見光區(qū)均無吸收. 京尼平水溶液與絲素蛋白水溶液混合后在35 ℃條件下反應(yīng). 反應(yīng)初期，290 nm及380 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，推測可能是反應(yīng)的中間產(chǎn)物，隨后原來各自的紫外吸收峰降低，而在590 nm附近出現(xiàn)一個新的特征光吸收峰，這與溶液呈現(xiàn)為藍(lán)紫色相吻合(圖3). 并且隨著反應(yīng)時間的延長，590 nm吸收峰不斷增高，A590 nm值不斷增大，說明所生成的顏色產(chǎn)物的最大特征光吸收值在590 nm附近. 文獻(xiàn)曾報道，京尼平與氨基酸反應(yīng)后生成的梔子藍(lán)色素的特征光吸收峰也在590 nm附近[16].
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